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熒光定量PCR儀技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用(一)
2012-06-19
1 概述
熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)將熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)應(yīng)用于常規(guī)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR儀中，從而進(jìn)行定量檢測。FRET即是通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極一偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體發(fā)色團(tuán)，轉(zhuǎn)移效率與曲個發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例。與普通定量PCR相比，熒光定量PCR儀具有可實(shí)時監(jiān)測、準(zhǔn)確性高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，本文綜述目前國內(nèi)外幾種熒光定量PCR儀技術(shù)及應(yīng)用。
2 熒光定量PCR 方法
2.1 TagMan
TagMan技術(shù)是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能夠裂解雙鏈DNA5 端核苷酸，釋放出單個或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置換了的具有又樣結(jié)構(gòu)的單鏈DNA，水解作用發(fā)生于結(jié)合了置換部位的磷酸二酯鍵處?；赥ag酶的這種活性，設(shè)汁合成一個能與PCR產(chǎn)物雜交的探針，該探針的5 端標(biāo)記一個熒光分子.3 端標(biāo)記另一個熒光分子。其中3 端熒光分子能夠吸收5 端熒光分子發(fā)出的熒光，因此，正常情況下該探針檢測不到3 端熒光分子的熒光信號，但當(dāng)溶液中有PCR 產(chǎn)物(模板)時，該針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Tag酶5 外切酶活性，將探針5 端連接的熒光分子從探
針上切割下來，破壞了兩熒光分子間的FRET，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。因此，根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計算出初始模板的量。其主要不足是：
2.2 Molecular beacon
分子信標(biāo)技術(shù)(molecular beacon)也是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和淬滅分子，與Tag Man探針不同的是，該探針5 和3 末端自向形成8個堿基左右的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，于是溶液便產(chǎn)生了熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。該方法的特點(diǎn)是采用非作為淬滅分子，熒光本底低 其不足之處是：(1)雜交時探針不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差;(2)探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜
近來，基于Molecular beacon的原理，人們對其進(jìn)行改進(jìn)，使用了一種發(fā)卡式引物(sunrise primer).此法能將所有擴(kuò)增產(chǎn)物均標(biāo)記上熒光分子，因此熒光信號響應(yīng)快。但無法區(qū)分特異和非特異擴(kuò)增是致命不足 為了克服不足，人們義對其進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)明了一種稱為蝎狀引物(scorpion primer)的熒光定饋PCR技術(shù)。該技術(shù)在引物與Molecular beacon探針之間連接一個間隔臂，使PCR延伸反應(yīng)時不能夠延伸至Molecular beacon分了 這樣，非特異擴(kuò)增產(chǎn)物便無熒光信號，但當(dāng)有物異擴(kuò)增產(chǎn)物時， 即可與Molecular beacon進(jìn)行分了內(nèi)雜交， 產(chǎn)生熒光信號既解決了非特異問題，又保留了響應(yīng)快的特點(diǎn)。但仍存在雜交時， 探針不能完全與模板匹配及合成復(fù)雜的問題.
2.3 Amplisensor
Amplisensor是一種復(fù)合探針技術(shù)，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一種淬滅物。 探針長度不同，其中淬滅物標(biāo)記探針5 端多出7個堿基(GCGTCCC)。PCR擴(kuò)增前需將熒光物標(biāo)記探針與一個半套式PCR引物連接，PCR儀引物的5 應(yīng)有一段與長探針互補(bǔ)的序列. 以便連接酶將該引物與短探針連接。擴(kuò)增時該探針一引物復(fù)合物作為半套式引物摻入模板，從而釋放淬滅探針部分，破壞了熒光能量傳遞，產(chǎn)生熒光。熒光的強(qiáng)度與擴(kuò)增時加入的模板數(shù)成正比。該方法主要特點(diǎn)：(1)采用半套式PCR擴(kuò)增，提高了靈敏度，但無法區(qū)分引物二聚體形成產(chǎn)生的非特異擴(kuò)增信號，使定量準(zhǔn)確度受到影響;(2)每次PCR擴(kuò)增前，要先進(jìn)行Amplisensor的標(biāo)記，增加了操作步驟和檢測成本;(3)中間需加入半套式引物，增加了污染機(jī)會。
2.4 Lightcycler
Lightcycler是新近發(fā)展起來的一種定量PCR技術(shù)，該技術(shù)將熒光分子和淬滅分子分別標(biāo)記在兩個不同的探針上，形成發(fā)光探針和淬滅探針，發(fā)光探針的5 端與淬滅探針的3 端分別連接熒光分子。兩探針設(shè)計為可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交，雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此進(jìn)行定量分析。該方法淬滅效率高，但由于兩個探針結(jié)合于模板上，因此影響擴(kuò)增效率。此外，由于需合成兩個較長探針，合成成本較高。
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