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熒光定量PCR儀選擇要規(guī)避的問(wèn)題
2012-06-19
熒光定量PCR選擇的兩個(gè)誤區(qū)：
誤區(qū)一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，多重?cái)U(kuò)增越來(lái)越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從，就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。
在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種)或?qū)Ｓ玫腞eference dye ，這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來(lái)，真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購(gòu)買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。考慮多重?zé)晒舛縋CR的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。
誤區(qū)二：real-time PCR儀無(wú)需梯度功能
對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值)，但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果，退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題——在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過(guò)程，簡(jiǎn)化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn)，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。
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